Western blot常見(jiàn)問(wèn)題分析（下）
Western blot（WB）是實(shí)驗(yàn)室中常見(jiàn)且重要的一種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法
具體的實(shí)驗(yàn)原理和實(shí)驗(yàn)步驟在前幾期中已經(jīng)做了詳細(xì)的介紹，實(shí)驗(yàn)步驟大致分為：蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、清洗、二抗孵育、清洗、蛋白檢測(cè)。步驟復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，容易出現(xiàn)各種問(wèn)題，尤其對(duì)于新手來(lái)說(shuō)更是一個(gè)挑戰(zhàn)。為了讓大家能夠?qū)⑦@個(gè)實(shí)驗(yàn)做到完美，本期就簡(jiǎn)單向大家總結(jié)歸納了WB實(shí)驗(yàn)中常見(jiàn)的一些問(wèn)題，并給出了解決方案，目的是為了讓大家了解WB實(shí)驗(yàn)中的注意點(diǎn)和規(guī)范操作的必要性，同時(shí)也是方便大家在出現(xiàn)問(wèn)題后能夠及時(shí)分析出原因，調(diào)整實(shí)驗(yàn)方案，得到預(yù)期結(jié)果。
我們將常見(jiàn)問(wèn)題總結(jié)歸納為背景高、條帶形狀異常、非特異性條帶、沒(méi)有條帶或條帶弱4大類。
本期我們接著介紹非特異性條帶、沒(méi)有條帶或條帶弱這兩種常見(jiàn)問(wèn)題。
一、非特異性條帶
| 原因分析 | 建議解決方案 |
| 一抗?jié)舛冗^(guò)高 | 降低一抗稀釋濃度，減少非特異性條帶 |
| 一抗特異性不高 | 可更換抗體 |
| 蛋白樣本降解 | 提取蛋白時(shí)可加蛋白酶抑制劑，全程冰上操作 |
| 目的蛋白可能存在多個(gè)剪切體 | 查閱說(shuō)明書(shū)和文獻(xiàn)進(jìn)行參考 |
| 一抗不純，被其他抗體污染 | 重新配制新的一抗溶液 |
二、沒(méi)有條帶或條帶弱
| 原因分析 | 建議解決方案 |
| 一抗/二抗?jié)舛鹊停瑫r(shí)間短 | 增加抗體濃度，延長(zhǎng)孵育時(shí)間 |
| 一抗/二抗不匹配 | 確定抗體的種屬性 |
| 蛋白樣本濃度低 | 增加樣本的上樣量 |
| 蛋白降解 | 重新制備樣品，增加陽(yáng)性樣本對(duì)照 |
| 轉(zhuǎn)膜不充分，或轉(zhuǎn)時(shí)間久了 | 轉(zhuǎn)膜后染色看轉(zhuǎn)膜的效果，控制轉(zhuǎn)膜的時(shí)間和電流 |
| 轉(zhuǎn)膜正負(fù)極反了 | 轉(zhuǎn)膜時(shí)認(rèn)真檢查裝置和轉(zhuǎn)膜夾放置的方向 |
| 過(guò)度洗膜 | 要控制洗膜時(shí)間，不宜過(guò)長(zhǎng) |
| 過(guò)度封閉 | 減少封閉時(shí)間，或更換封閉液 |
| 二抗標(biāo)記的HRP失效 | 檢查是否使用含疊氮化鈉的試劑或容器 |
從上面的問(wèn)題分析可以看出在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中會(huì)出現(xiàn)很多人為操作上的失誤，比如封閉時(shí)間、清洗時(shí)間、抗體孵育時(shí)間的控制；抗體孵育的溫度條件；保持膜的濕潤(rùn)等。為了避免這些人為操作所導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗的因素，可以通過(guò)使用我司研發(fā)的一款A(yù)W系列全自動(dòng)清洗工作站，從封閉到顯色之前都可以在這臺(tái)設(shè)備中完成，即可以控制時(shí)間和溫度，也大大節(jié)約了人為參與的時(shí)間，降低人為誤差，提高實(shí)驗(yàn)成功率。
（發(fā)布于：2022-04-20）