AW系列全自動(dòng)清洗工作站技術(shù)特點(diǎn)介紹（一）
Western blot 是對(duì)目的蛋白進(jìn)行檢測(cè)的一種實(shí)驗(yàn)方法，大致分為：蛋白提取、蛋白定量、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗原-抗體免疫反應(yīng)（一抗孵育、二抗孵育）、蛋白檢測(cè)。具體的步驟和原理前面已有介紹，本次的主題主要針對(duì)AW系列產(chǎn)品的技術(shù)特點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)介紹，主要分為溫控、高通量、高回收率三大技術(shù)特點(diǎn)。結(jié)合儀器技術(shù)特點(diǎn)便于大家對(duì)本產(chǎn)品的應(yīng)用有更深入的了解，這一期我們先介紹AW-12產(chǎn)品的溫控技術(shù)特點(diǎn)在Western blot實(shí)驗(yàn)中的具體應(yīng)用。
溫控技術(shù)特點(diǎn)在Western blot實(shí)驗(yàn)步驟中的重要性主要體現(xiàn)在抗原-抗體免疫反應(yīng)和顯影前的膜片浸泡（貯存）兩方面。
一 抗原-抗體免疫反應(yīng)
也就是western blot實(shí)驗(yàn)步驟中的一抗孵育和二抗孵育。在這個(gè)步驟中抗體的選擇、抗體的稀釋比例、抗體的孵育時(shí)間以及溫度對(duì)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果都是十分的重要，每一個(gè)環(huán)節(jié)都不能出問題，否則都會(huì)嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。
抗原-抗體免疫反應(yīng)示意圖
一抗孵育
一般我們會(huì)首選與目的蛋白特異性結(jié)合的單克隆抗體（即單抗），之前大多都傾向于選擇國(guó)外的一些品牌，近來國(guó)產(chǎn)抗體也相繼出現(xiàn)一些優(yōu)秀的品牌可供選擇。然而對(duì)于沒有單抗的抗體則會(huì)選擇有實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證或有文獻(xiàn)作為參考的多克隆抗體（即多抗）。一抗與目的蛋白表面的抗原表位結(jié)合，而膜表面的非特異性位點(diǎn)因?yàn)楸环忾]過程中牛奶的蛋白質(zhì)所結(jié)合，因此與一抗的結(jié)合量很少，結(jié)合的抗體也會(huì)在一抗清洗時(shí)被去除。一抗孵育的溫度和時(shí)間，最常用的有兩種條件：1）4℃搖床過夜孵育，溫度適宜，分子運(yùn)動(dòng)溫和，一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合充分；而且低溫（4℃）條件下也可以提高抗體的回收利用率，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。2）37℃搖床孵育1-2h，但溫度越高，分子間的運(yùn)動(dòng)能力增強(qiáng)，出現(xiàn)非特異性結(jié)合的可能性就越高；同時(shí)孵育時(shí)間較短，也可能會(huì)導(dǎo)致一抗與目標(biāo)蛋白結(jié)合不充分。但對(duì)于一些非常好用的抗體，這個(gè)孵育條件也是可以的，但是不利于抗體的回收利用，室溫條件會(huì)大大降低抗體的活性，影響抗體的重復(fù)利用。
然而無(wú)論實(shí)驗(yàn)人員選擇哪一種一抗孵育的時(shí)間和條件，AW-12都可以滿足要求，AW-12具備了低溫貯存、低溫和室溫孵育功能，低溫貯存功能可以使貯存的抗體在實(shí)驗(yàn)過程中始終保持在低溫狀態(tài)，有利于維持抗體的活性；低溫和室溫孵育功能可根據(jù)實(shí)驗(yàn)人員的具體實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇，時(shí)間和抗體是否回收也可根據(jù)需求自行設(shè)置，操作簡(jiǎn)單且十分人性化，完全滿足實(shí)驗(yàn)人員對(duì)抗體孵育的各種要求。
二抗孵育
一抗結(jié)合之后，就是選擇與一抗結(jié)合的二抗，而二抗蛋白結(jié)構(gòu)被HRP（辣根過氧化物酶）標(biāo)記，可與發(fā)光底物相結(jié)合，該底物極強(qiáng)的信號(hào)輸出使得目的蛋白被檢測(cè)到，因此得到顯影結(jié)果。二抗孵育的一般條件是室溫1h，為了防止二抗孵育和清洗時(shí)間過久導(dǎo)致HRP信號(hào)減弱，因此可以選擇在低溫條件下清洗二抗，AW-12只需要在二抗清洗步驟中將溫度設(shè)為低溫即可，也可選擇在室溫條件下清洗，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行選擇即可。
二 膜片浸泡（貯存）
抗原-抗體免疫反應(yīng)完成后，如果不及時(shí)進(jìn)行顯色曝光，就需要將膜片浸泡在清洗液（PBST/TBST）中并保存在低溫環(huán)境中，保持膜片上的抗體活性和二抗上HRP的信號(hào)。如果是手工操作實(shí)驗(yàn)，最后膜片浸泡時(shí)需要將膜片孵育盒放到4℃冰箱中保存，等待實(shí)驗(yàn)人員顯色曝光；而使用AW-12進(jìn)行實(shí)驗(yàn)時(shí)，我們儀器默認(rèn)的程序設(shè)置是在膜片浸泡時(shí)始終保持在低溫狀態(tài)，直到實(shí)驗(yàn)人員將膜片拿出顯色曝光。
抗原-抗體免疫反應(yīng)步驟手工與AW-12對(duì)比圖
從上述對(duì)比圖也可以明顯看出使用AW-12來完成抗原-抗體免疫反應(yīng)至顯色曝光這一段實(shí)驗(yàn)流程，不僅可以大大節(jié)約實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間，AW-12的低溫貯存功能和低溫、室溫孵育功能更能靈活的滿足實(shí)驗(yàn)的各種需求。
（發(fā)布于：2021-08-26）