AW-12全自動清洗工作站使用報告（1）

AW系列全自動工作站是根據(jù)Western Blot實驗需要，通過儀器代替繁瑣、重復、枯燥的人工試驗。AW-12是捷美自主研發(fā)的一款全自動化的Western Blot操作系統(tǒng)，自動化實現(xiàn)制冷低溫儲存、封閉、孵育、洗膜、回收一抗和二抗的整套流程。數(shù)控操作流程可避免手工的操作誤差，降低背景，提高信噪比和相對靈敏度，確保同批次和不同批次間實驗的可重復性。

1 實驗目的

AW-12全自動清洗工作站應用，進行手工和儀器處理的效果對比，驗證儀器使用的可靠性。

2 實驗原理

蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot。它是分子生物學、生物化學和免疫遺傳學中常用的一種實驗方法。其基本原理是通過特異性抗體對凝膠電泳處理過的細胞或生物組織樣品進行著色。通過分析著色的位置和著色深度獲得特定蛋白質(zhì)在所分析的細胞或組織中表達情況的信息。

3 實驗準備

3.1 實驗試劑

3.2 實驗儀器

3.3 樣品制備

3.3.1 細胞準備（293T細胞為例）

3.3.1.1 細胞復蘇

將凍存的細胞從液氮中取出，并立即放入37℃水浴中，左右晃動凍存管直至管內(nèi)液體全部融解。然后將液體加入裝有 9mL 培養(yǎng)基的離心管中，立即混勻。離心4℃，300×g，5min。棄去上清，細胞沉淀用10% FBS、5ml 雙抗（青霉素10000U/ml，鏈霉素10000U/mL）的DMEM高糖完全培養(yǎng)基懸浮后轉入培養(yǎng)瓶中，最后將細胞培養(yǎng)瓶放進37℃，5% CO2 培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

3.3.1.2 細胞培養(yǎng)

293T細胞DMEM高糖完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃，5% CO2 飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)，當293T細胞生長至培養(yǎng)皿底部90%左右時傳代，用含有0.25%胰酶的細胞消化液消化，消化一段時間后用含有血清的完全培養(yǎng)基終止，傳代或鋪板。待細胞處于對數(shù)生長期時進行實驗。

3.3.2 蛋白裂解

（1）從細胞房CO2培養(yǎng)箱中取出細胞拿回實驗室進行操作。

（2）用移液器吸取細胞培養(yǎng)皿中的細胞培養(yǎng)液棄去，每個細胞培養(yǎng)皿中加入預冷的PBS 清洗一遍，棄去PBS。（一定要吸凈，否則會影響蛋白的濃度)。加入適量的細胞裂解液進行裂解（10cm 細胞培養(yǎng)皿中大約加500μl），輕輕搖晃均勻。

（3）冰上裂解20分鐘。

（4）裂解后的細胞小心的用移液槍吹打，盡量不要吹出氣泡。吸取液體，置于預先標記好的EP管中，在冷凍離心機中12000×g離心15分鐘（全部操作都要在冰上進行，冷凍離心機要提前預冷)。

（5）吸取離心后的上清液轉移至預先標記好的新的EP管中，注意不要吸到沉淀，可以用冷凍離心機瞬離，保證沒有氣泡。進行下一步處理或保存于-80℃冰箱。

3.3.3 煮樣

利用BCA試劑盒測蛋白樣品的濃度，并將其總蛋白濃度制成3mg/ml，加5×loading buffer振蕩混勻后，置于100℃金屬浴中10min，蛋白變性，制好的蛋白樣待上樣或保存在-20℃。

（發(fā)布于：2021-04-29）